重组人源超氧化物比方化酶钻研妨碍（一）

超氧化物比方化酶是重组钻研植物、植物以及微生物中普遍存在的人源一类酶，是超氧生物抗氧化零星的第一道防线，也是化物化酶体内仅有可能特异性翦灭氧逍遥基的抗氧化酶。SOD为金属酶，比方按其散漫的妨碍金属离子种类差距，当初已经知的重组钻研SOD主要分为三类，即Cu/Zn-SOD（SOD1）、人源Mn-SOD（SOD2）以及Fe-SOD（SOD3）。超氧人体内外源化合物在种种酶的化物化酶熏染下会发生氧逍遥基，氧逍遥基在SOD的比方催化熏染下转变为过氧化氢，体内的妨碍过氧化氢酶（CAT）以及过氧化物酶（POD）会赶快将其分解为残缺有害的水（图1）。当生物体不饶富多的重组钻研SOD时，活性氧将会大批积攒，人源如不能实时翦灭就会激发氧化伤害，超氧导致机体伤害，好比碱基突变、DNA链断裂、膜脂过氧化以及卵白质伤害等，从而减速朽迈或者导致疾病。除了抗氧化熏染外，SOD还具备抗炎、抗肿瘤及调控免疫等紧张熏染，而且在免疫侵略中起杀去世病毒的熏染。SOD具备普遍的医疗价钱，临床上可用SOD治疗以及提防急性炎症以及水肿、氧中毒、肺气肿、辐射病、暮年性白内障及朽迈等。此外，SOD还可能作为食物以及化装品的削减剂。

外洋主要从牛羊等植物的血液中提取SOD，国内主要从猪的血液中提取SOD。植物源头的SOD存在与人交织熏染、过敏性反映等不良天气。此外，由于疯牛病等致病因子的转达，从植物血液中提取SOD的清静性受到严正质疑。欧盟于1999年已经防止将植物源头的SOD用于人类医疗以及保健。但由于从植物血液中提取SOD老本低、工艺重大，至今无奈周全防止。做作SOD在运用方面有其规模性：①半衰期短（5～10min），代谢快捷；②异源性—由于做作SOD的制剂多源头于植物或者微生物，对于人体来说存在免疫原性下场；③不易透皮或者透膜，罗致难题。做作SOD属于大份子卵白，在细胞膜上不专一受体，难以快捷进入细胞内发挥熏染。多年来人们不断不断试验种种措施来取患上SOD并刷新其妄想以及性子，从而拓展其运用规模。罕用的措施有化学修饰法、SOD模拟化合物以及基因工程法等，其中经由基因工程技术取患上以及刷新SOD的相关钻研睁开尤为快捷。1983年，Sherman等初次克隆患上到人源Cu/Zn-SOD（hCu/Zn-SOD）的cDNA序列，为经由基因工程取患上以及刷新SOD奠基了根基。近些年来，迷信家们经由基因工程技术，并散漫细胞工程、酶工程、卵白质工程以及微生物工程等技术，大大增长了重组SOD在医药规模的运用。当初，基因工程在工业化破费SOD中的位置愈发紧张，与化学修饰法以及SOD模拟化合物措施比照，基因工程广开酶源，后劲重大，是飞腾SOD破费老本以及取患上无抗原性人源SOD的实用道路。

当初，对于SOD的综述有良多，钻研者们分说从SOD的源头、分类、功能以及催化机理等方面妨碍了总结，并摆列了SOD在医学、农业、化装品以及食物开拓等方面的运用现状及远景。本文重点综述了重组人源SOD的钻研策略与妨碍，以期为SOD的实际钻研与实际运用提供参考。

一、表白零星的抉择

抉择适宜的表白零星是抉择重组人源SOD高效表白的严主因素（表1）。在抉择卵白表白零星时，需要思考的主要因素是卵白活性、可溶性、患上率及哺育周期等。

一、大肠杆菌表白零星

在种种表白零星中，最先睁开钻研的是大肠杆菌表白零星，它也是当初最成熟的表白零星。大肠杆菌表白零星具备遗传布景清晰、表白量高、孳生快、老本低、晃动性好、抗传染能耐强以及产物简略纯化等短处。张弘浩等将人源SOD基因导入大肠杆菌，患上到容纳体方式的重组卵白，经由尿素处置、透析，重组卵白由容纳体转化为可溶性卵白。钻研指出Cu²⁺、Zn²⁺的退出对于复原SOD的活性以及晃动性是必不可少的，且适以落伍温度将大大延迟复性光阴，取患上的重组人源SOD比去世气愿望可抵达6000U/mg以上。Zhu等克隆了人源胞外超氧化物比方化酶的cDNA，并在大肠杆菌中妨碍了重组表白，患上到容纳体方式的重组卵白。经由尿素处置取患上可溶性卵白，并经由牢靠化金属亲以及层析柱对于重组hEC-SOD妨碍逐渐复性，患上到了精确折叠的二聚体卵白以及单体卵白，两种卵白的比去世气愿望分说为3475U/mg以及510U/mg，二聚体的活性清晰高于单体。

大肠杆菌表白零星虽有良多短处，但存在卵白不能精确折叠、易组成容纳体、明码子系统与真核生物差距较大、翻译后修饰不美满以及内毒素等运用瓶颈。

二、酵母表白零星

酵母表白零星可高水平表白卵白，并具备翻译后修饰功能，兼具原核与真核表白零星的短处，因此在基因工程规模中患上到日益普遍的运用。其中甲醇酵母表白零星是当初运用最普遍的酵母表白零星，并以毕赤酵母运用至多。酿酒酵母渗透外源卵白功能低，且大规模发酵时发生的乙醇会影响菌体自己妨碍，因此难以妨碍高密度发酵。林士森等将hEC-SOD在毕赤酵母中表白，从上清液中取患上重组卵白，经纯化后测患上重组卵白的比去世气愿望为1700U/mg。郑屹峰等以表白hCu/Zn-SOD的重组毕赤酵母为动身菌株，接管甲醇-甘油混合饲喂的措施妨碍5L发酵罐高密度发酵哺育，最终取患上的重组hCu/Zn-SOD比去世气愿望抵达13539U/ml。毕赤酵母表白系统表白的重组卵白可能直接渗透至胞外，故有利于工业化分说与纯化，其表白的卵白可能组成二硫键、妨碍糖基化修饰等，且表白量高。可是，毕赤酵母表白系统缺少之处在于运用甲醇作为诱惑剂，具备确定危害，且糖基化与哺乳植物细胞有所差距。

三、植物表白零星

植物表白零星可能表白来自病毒、细菌以及植物等的卵白，易于大规模哺育与破费，在基因表白及修饰方面也有配合的优势。当初已经在烟草、水稻、红花以及马铃薯等植物中实现为了良多外源卵白的表白。由于烟草具备生物产量高、转化重大、不进入食物链及生物清静危害小等优势，因此成为当初睁开最成熟的植物表白系统。Park等经由植物刹时表白零星在烟草叶细胞中表白出具备催化活性的重组hEC-SOD，为植物表白零星破费重组SOD开启了新的大门。但由于运用植物表白破费外源卵白相关技术起步较晚，部份技术并非特意成熟，因此当初运用植物零星破费目的卵白与其余零星比照尚不具备相助力。

三、昆虫细胞表白零星

20世纪80年月起，以杆状病毒为载体的外源基因表白系统日益成熟，极大增长了昆虫细胞表白零星的睁开。昆虫细胞表白零星既能表白原核基因也能表白真核基因，并兼具了原核表白零星产量高以及真核表白零星卵白翻译后修饰的短处。昆虫细胞表白载体接管了昆虫核型多角体病毒中多角体卵白基因的强启动子，可能实现良多真核卵白的实用表白。罕用的宿主细胞则源头于草地贪夜蛾的Sf-9以及Sf-21细胞系。范立强等将hEC-SOD基因插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBacHTb中，再将其转染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4，SDS-PAGE以及Westernblot服从展现hEC-SOD在粉纹夜蛾细胞中乐成表白，其细胞裂解物中的hEC-SOD比去世气愿望为260U/mg。Shrestha等将全长以及截短的hEC-SOD基因分说克隆到供体质粒pFastBacHTb，并转染到SF9杆状病毒表白零星，也乐成表白出了有活性的全长以及截短的hEC-SOD，且Westernblot展现重组hEC-SOD同时以单体（33kD）以及二聚体（66kD）方式存在。

昆虫细胞表白零星可能同时表白数个外源基因，在破费卵白复合体时特意实用。当初，昆虫表白零星已经普遍运用于疫苗破费以及重组病鸩杀虫剂等泛滥规模。但由于鳞翅类昆虫的卵白加工道路以及低等真核生物差距，且杆状病毒熏染可能对于宿主的卵白加工具备负面影响，因此其运用还存在确定的限度。

五、哺乳植物细胞表白零星

普残缺过质粒转染或者病毒载体熏染的措施在哺乳植物细胞中表白外源卵白。运用病毒表白系统可能快捷熏染细胞，在多少天内使外源基因整合到病毒载体中，而运用质粒转染取患上晃动的转染细胞则需要多少周致使多少个月光阴。Lu等接管编码hCu/Zn-SOD以及hEC-SOD的两个序列，以及山羊β-酪卵白的5'端以及3'真个调控元件，构建了乳腺特异性表白载体，经由共转染法制备山羊胚胎成纤维细胞作为供体细胞，Westernblot检测展现重组hCu/Zn-SOD以及hEC-SOD在转双基因山羊乳腺中均有表白。散漫酶联免疫吸附试验（ELISA）展现，重组hCu/Zn-SOD的表白量为100.14mg/L，重组hEC-SOD的表白量为279.10mg/L。酶活性测定服从展现，羊奶中重组hCu/Zn-SOD以及hEC-SOD的总生物活性为1451U/ml。这些服从证明了哺乳植物细胞具备破费重组SOD的后劲。

申明：本文所用图片、翰墨源头《中国食物削减剂》，版权归原作者所有。如波及作品内容、版权等下场，请与本网分割

相关链接：氧化物，大肠杆菌，毕赤酵母，二聚体

(责任编辑：时尚)